2023年4月10日发(作者:麦克白读后感)

74 化学分析计量 2008年,第l7卷,第3期

单线态氧的检测及分析应用研究进展木

吕庆銮 张 苗 岳宁宁 王怀友

(山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250014)

摘要综述了单线态氧( O )的测定方法。介绍了单线态氧的ESR、磷光光度、分光光度、化学发光和荧光法的

基本原理、方法研究进展和分析应用情况,并重点介绍了化学发光法和荧光法,同时比较了这几种方法的特点。

关键词单线态氧化学发光 荧光评述

近年来,活性氧分子对人体健康的影响受到了人们极大

的关注。所谓活性氧就是氧的某些中间代谢产物或含氧的

衍生物质具有比氧更强的氧化能力。活性氧类型主要有:超

氧阴离子(O 一)、过氧化氢(H O )、羟基自由基(’OH)、单

线态氧( O )和脂质过氧化自由基(ROO’)等。通常呼吸的

氧气是一种稳定的基态氧分子,而单线态氧分子则与之不

同,它是一种处于激发态氧分子的存在形式,其化学性质更

活泼,较基态更不稳定。通常所说的单线态氧一般指的就是

在自然界中广泛存在的第一激发态的单线态氧

△ ( O )㈦。

美国化学家Foote对单线态氧的产生及其特性做了大量

研究。许多报道表明,在酶反应、细胞分裂、机体衰老、吞噬

杀菌、肿瘤、化学中毒、辐射损伤、环境污染和有机合成等方

面都有单线态氧的作用 。j。在正常情况下,单线态氧水平

很低不会引起伤害,细胞内单线态氧的产生与清除处于一种

动态平衡状态。一旦这种平衡被打破,就可能产生伤害作

用,导致膜脂过氧化或脱脂化,膜差别透性丧失,离子大量外

渗,引起一系列生理变化、代谢紊乱、严重时导致细胞死亡。

目前,尽管人们已经充分认识到了单线态氧等活性氧分

子、自由基在环境化学、生命科学研究中的重要性,但是由于

其寿命短、反应活性高,活性氧的分析测定仍然是一项国际

性难题,采用的分析方法主要有电子顺磁共振法、磷光光度

法、分光描写春天的四字成语 光度法、谱法、化学发光法和荧光光度法。

1电子顺磁共振法(ESR)

ESR探针的检测原理是单线态氧的ESR自旋捕获剂,与

单线态氧作用后导致ESR信号的变化。自从1976年Lion

建立了用ESR的方法检测单线态氧后 J,该方法被大量用

于光敏化过程中单线态氧的测定 ‘ 。

Das等利用TEMP(2,2,6,6-tetramethyl-4一piperidine)…

为探针评价了硫氧还蛋白对单线态氧的猝灭和HO’的清除

作用。Inoue等以2,2,6,6-tetramethyl-4一piperidone(4 OXO—

TMP) 12]作为单线态氧的选择性捕获剂,研究了二北京的特 氧化钛乙

醇溶液光激发产生的单线态氧和超氧阴离子。Junichi等利

用另一种ESR探针DRD156[4,4’一bis(1-p-carboxyphenyl一3.

methyl-5-hydroxy1)pyrazole] 13 J,通过口一胡萝卜素对单线态氧

的猝灭研究了光动力杀伤癌细胞的原理。

ESR法灵敏度高,选择性好,但测定的ESR信号同样也

受到共存离子、溶剂等条件的影响,使得定量检测误差较大。

同电脑自带截图 时仪器昂贵,操作程序相对复杂。

2磷光光度法

由于激发态氧分子的能量高于基态,电子由激发态跃迁

回基态时,会以光的形式释放能咸菜的做法大全 量而发出磷光,这种性质可

被用来检测单线态氧。通常有两种跃迁方式: O 一0 +

(1 268 nm);2‘0,__+20,+hv(634 nm和703 nm)。1 268 nm

的发光属于‘0,的特异发光波长已被公认,通过测定这一波

长的发光来确定 0,的方法已得到广泛地应用。磷光光度法

已经成为最直接、准确检测单线态氧的方法。各种光敏化体

系和酶催化氧化还原体系中产生的单线态氧被大量研究,为

人们认识单线态氧在生命体中的重要作用提供了有力的证

据 。

但这种辐射的强度相当微弱,需要高灵敏的光学探测手

段才能探测到。为了提高检测的灵敏度,时间分辨磷光法得

到了大量应用 ]。Moln ̄等引利用时间分辨磷光法检测

了在脂质体中血卟啉衍生物(HPD)和原卟啉D((PpIx)产生

的单线态氧,阐明了光敏剂和单线态氧在复杂环境中的能量

转移。

Khalil等 提出了用近红外InGaAs光电二极管成像通

过卟啉光敏化产生磷光测量了氧气压力(浓度)的新方法。

此光电二极管的使用,大大提高了磷光检测法的灵敏度。

近年,Baier 等人用红外光电倍增管检测了不同溶剂

中的9种不同的光敏剂产生的单线态氧的发光信号,讨论了

猝灭剂和氧气浓度对单线态氧寿命的影响。此检测器比一

直延用的低温锗二极管检测器的灵敏度大为提高。

尽管单线态氧在D O中的寿命(约76 s)比在H O中

(约3.5 s)要长很多,但是检测需在D O环境中,无法满足

生理条件下检测的需要。更重要的是在单线态氧浓度较低

时,磷光光度法往往不能满足定量分析的要求。

3分光光度法和谱法

谱法,尤其HPLC,大多利用紫外检测器,依据探针捕

获单线态氧前后吸光度的变化进行测定,故在此把分光光度

法和谱法一起论述。

十山东省自然科学基金项目(Y2006B31)

收稿13期:2008—03—10

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吕庆銮,等:单线态氧的检测及分析应用研究进展 75

9.10一diphenylanthracene(DPA)是最常用的化学捕获剂,

其与单线态氧可以快速反应生成稳定的内氧化物,反应常数

为1.310 L/(mol・S),通过用紫外分光光度计测定DPA

在355 nm的吸光度的减少量即可以测量单线态氧的含量,

该方法已经被用于测定刺激性吞噬细胞中的单线态氧 ll J。

Mascio等合成了Ⅳ,Ⅳ’一d 一(2,3-dihydroxypropy1)一9,10一

anthracenedipropanamide(DHPA) ,一种水溶性单线态氧捕

获剂,易于细胞内检测。实验中以Ⅳ,Ⅳ’一 (2,3一

hydroxypropy|)一1,4-naphthaJenedipropanamide(DHPN),——种

萘的内氧化物衍生物加热分解产生单线态氧,DHPA专一捕

获单线态氧,然后以HPLC~MS分析产物。

Lemp等 合成了3种脂溶性的2,5一二甲基呋喃衍生

物,结构上的特点是2,5位上一个被不同的烷基链取代,一

个被三甲基铵卤化物取代,结果可使探针穿越膜进入脂双

层。探针与单线态氧反应具有极大的速率常数,因此物理猝

灭和介质影响可忽略。笔者讨论了单线态氧进入脂双层的

不同深度时,其动力学行为、分散的均一性,并且测定了分布

其中的单线态氧的浓度为2.710 mol/L。

在吸光光度法中应用的其它探针还有:Sodium 1,3-Cy.

clohexadiene一1,4-Diethanoate(CHDDE) ,1,3-diphenyliso—

benzofuran(DPBF)衍生物 27 J,tert—butyl一3,4,5-trmethy|pyr—

rolecarboxylate(BTMPC) ,bis-9,10一anthracene一(4.trimeth.

ylphenylanamonium)dichloride(BPAA)I29]等。

虽然光度探针得到广泛应用,但其自身存在着不可避免

的缺点,即这类探针试剂往往自身不稳定易被光和空气中的

氧气所氧化,并且方法灵敏度较差。

4化学发光法

化学发光探针的检测原理是探针分子与单线态氧反应

生成能量较高的化合物,这些产物或生成后迅速分解并以光

的形式放出能量或与引发剂作用发出可检测的信号。目前,

用于检测单线态氧的化学发光探针主要有如下几类:

4.1 海萤萤光素类似物(CLA)及其衍生物MCLA、FCLA

CLA,1970年由日本化学家Sugiura等 。‘人成功地合成

了这一试剂,CLA的特点是不与生物机体内的H O 或者OH

发生反应,只与 O 或者O 一 发生特异性的化学发光反应,

发光波长为380 nm 。要实现对 O,的专一反应,可通过加

入O,一‘抑制剂来消除其干扰。

Suzuki等 人还开发了CLA的衍生物MCLA和FCLA.

Nakano和F ̄imori等 人对这一类试剂的化学发光机理

和反应的动力学作了详细的研究,报道了CLA,MCLA与活

性氧的化学反应机理。FCLA是目前化学发光试剂中发光波

长(532 nm)最长的试剂,发光效率比CLA高出近10倍,由

于这一特点,在进行生物样品中 O 或者O 一‘测定时,能够

有效地降低酶、‘OH等干扰物质的影响。

迄今为止,国内外开展了大量基于此类探针的应用。

CLA被应用于白血球的功能性检查方面的研究 ;邢达等

人在声动力肿瘤诊断方面做了大量实验,提出了化学发光探

针介导的声动力学肿瘤成像方法 ,l J。

4.2四硫富瓦烯(r丌F)取代的蒽衍生物探针

探针(A)4,5一二甲硫基4’_[2一(9一葸氧基)乙硫基]四硫

富瓦烯,其响应机理为:受r丌F活化的蒽单元首先捕获 O ,

生成了一种不稳定的内过氧化物,产生化学发光。

该探针只对 O 表现出较强的化学发光,具有很高的选

择性。检测中性条件下H O 一C10一产生的单线态氧,检测

限可达76 nmol/L,且发光强度与单线态氧浓度呈很好的线

性关系。Ma等用这种化学发光探针测定了亚铁离子催化叔

丁基过氧化氢所产生的单线态氧_3 。

Ma等又合成了探针(B)4,4’(5’)一双[2一(9一蒽氧基)

乙硫基]四硫富瓦烯,研究了对过氧化氢启动的人唾液体系

中 0 产生的测定,与CLA相比有更好的专一性 。

4.3 以二氧环丁烷为前躯体的化学发光探针

其检测机理为探针先与单线态氧反应生成二氧环丁烷,

二氧环丁烷再在引发剂作用下产生化学发光信号。这样可

有效地减少本底对信号的干扰,极大地提高了检测的灵敏

度。

McNeill等以此探针评价了有机中性溶液中照射腐殖质

酸溶液产生的单线态氧的分布微观不均一性,比常规的糠基

醇探针检测的单线态氧的浓度数量级要高,并研究了不同溶

剂中单线态氧分布的动力学模型 。

Ma和McNeill等报道的两类化学发光探针的水溶性差,

不利于生物体系中单线态氧的测定,另外也不能用于跟踪检

测随时间变化的单线态氧的生成量。

5荧光光度法

5.1 1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)及其衍生物作捕获剂

利用DPBF在455 nm处的荧光强度变化,主要用来评价

抗氧化剂抗氧化能力(清除单线态炒年糕的做法视频 氧的能力) 和光敏剂光

氧化产生单线态氧的相对量子产率大小 J。DPBF仅与

O 和O 一‘反应 ,而不与其它活性氧反应。但DPBF水

溶性差,只能在有机溶剂中进行。

5.2有机荧光探针

9,10一Dimethylanthracene(DMA)是一种荧光化合物

(A…/A =375/436),选择性地与单线态氧反应生成一种没

有荧光的内氧化物。Grosse等用DMA监测了血卟啉光氧化

释放的单线态氧在脂质体中的动力学过程 。近年来,开

发的新型单线态氧有机荧光分子探针主要包括两类:

(1)探针本身无荧光,与单线态氧反应后荧光显著增强。

这类化合物主要是蒽及其衍生物取代的荧光素分子9_[2.

(3-Carboxy-9,10.dipheny1)anthryl}-6.hydroxy.3H.xanthen-3.

ones(DPAXs)与单线态氧反应前,由于光诱导电子转移

(PET)对荧光的猝灭作用,化合物几乎无荧光。反应生成内

氧化物后,猝灭作用消失,探针发出强荧光。Nagano等人利

用此探针检测了弱碱性条件下MoO “一H 0 体系和中性条

件下3一(4一methyl一1一naphthy1)propionic acid endoperoxide热分

解产生的单线态氧。该法检测时间短、灵敏度高,但不适用

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76 化学分析计量 2008年

,第17卷,第3期

于低pH值环境和实时检测 50。Nagano等人又对DPAXs进

行了改进,合成的DMAX比DPAXs有更好的水溶性,荧光量

子产率高1.5倍,灵敏度高53倍,更有利于生物体系检

测 。

(2)接收单线态氧的能量传递后荧光显著增强。这类化

合物主要有酞菁染料(phthalocyanines)和紫菜嗪(por-

phyrazine)衍生物等,当接收到单线态氧的能量后,能在700

llm附近发出强烈的荧光,其信号能被激光脉冲的时问分辨

方法很容易地检测出来。但是使用有机荧光探针的测定方

法,激发光的散射光和样品产生的强本底荧光,会对测定产

生严重影响 。

5.3稀土荧光探针

基于稀土荧光配合物的长寿命荧光特征而发展起来的

时问分辨荧光检测技术,由于可非常有效地消除短寿命的散

射光和样品产生的本底荧光对测定的影响,因而可以极大地

提高测定灵敏度。

Song,Tan等人设计合成了此类探针:[4’-(9-蒽基)-2,

2’:6’,2”.联三吡啶-6,6”.二甲胺四乙酸一Eu”(A1TrA—

Eu”)和N,N,N ,N -E2,6-二(3’.胺甲基.1’.吡唑)-4.(9”.

蒽基)吡啶]四乙酸一Tb“(PATA—Tb“) 。其检测原

理是稀土配合物在与单线态氧反应前因强的(蒽环)三线态

一(含N配体)三线态猝灭作用几乎不发荧光,当与单线态

氧反应后猝灭作用消失,可发出强烈的稀土离子长寿命荧

光,而且具有快节奏歌曲 比普通荧光素分子更好的耐光漂白稳定性,将

探针分别用于弱碱性条件下MoO 一H O 体系,中性条件

下TMPyP光敏化体系和弱酸条件下辣根过氧化酶催化吲哚

乙酸耗氧氧化体系中单线态氧的测定都得到很好的结果,其

中,A1TrA—Eu“和PATA—Tb“对弱碱性条件下MoO 一

H O 体系中单线态氧的检测限分别为2.8 nmo ̄L和10.8

nmoL/L。

Song还对A1TrA—Eu”进行了改进,合成了[4’一(10一甲

基 一葸基)-2,2’:6’,2”一联三吡啶-6,6”一二甲胺四乙酸一

Eu”(MTrA—Eu“),它与 O 反应具有极大的反应速率常

数,成功应用于光敏剂标记的活细胞体系中单线态氧的时间

分辨荧光测定 。

以上两种探针具有好的水溶性、高稳定性、宽pH适用范

围、高的反应专一性和大的反应速率常数等优点,能更好地

适用于生物体系的测定。

6展望

从以上各种方法的比较看,ESR作为检测单线态氧的直

接法,要求专门的设备,操作程序复杂,而且定量误差大;磷

光法在单线态氧浓度较低时,定量误差也较大;分光光度法

和谱法的灵敏度不高;化学发光和荧光法均具有高的灵敏

度和低的检测限,是最有潜力开发新型探针作为检测单线态

氧的手段。

对单线态氧的深入研究将使人们进一步揭示出生物细

胞氧化衰老、诱发癌变等一些重大问题的机理,从而寻求或

开发出阻止衰老和癌症等方面的有效途径和方法,特别

是它的活体测定,对于解释生命机体的各种生理、病状等有

着重要的意义念珠 。

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APPLICATIoNS AND PRoGRESSES IN DETERMINATIoN oF SINGLET oXYGEN

Ln Qingluan,Zhang Miao,Yue Ningning,Wang Huaiyou

(College of Chemistry,Chemical Engineering and Materials Science,Shandong Normal University,Jinan 250014,China)

ABSTRACT The detection methods,progresses and analytical applications of singlet oxygen were reviewed.ESR,phosphores—

cence,spectrophotometry,chromatography,chemiluminescence and fluorescence methods were involved.Chemiluminescence and fluo・

rescence methods were summarized,and its characteristics were compared.

KEYW0RDS singlet oxygen,chemiluminescence,fluorescence,review

重庆欲“牵手”意大利 研发机器人监测水污染

不久前,在重庆南坪会展中心“中德意环境监测微系统

论坛”上,来自意大利圣安娜大学微工程技术中心P.Dario

教授向重庆发出合作邀请,希望与重庆的科研人员共同研

发,利用浮动式机器人和无线传感网络相结合的方法,监测

三峡库区的水污染。

据介绍,微电子机械系统(MEMS)是21世纪的高新技术

产业,现在已逐步走向市场,全球微电子机械系统市场的需求

量达到4OO亿美元。新的方式是在可移动的机器人身上装上

传感器,将传感器与浮动式机器人相结合来监测水污染。

P.Dario教授介绍,无线传感网络与机器人相结合可以

相互补充。将机器人置身于复杂的环境,无线传感网络“指

挥”机器人有选择地在某些需要监测的节点上,再由无线传

感网络中心远程控制,机器人现场反馈信,中心再传出处

理指令。这是非常具有操作性的,不仅简单,成本也低。

“以此类推,微电子机械系统可以用在监测水污染上,也

可以进一步考虑环保机器人,让它在城市中进行清洁和处理

垃圾。”P.Dario教授表示。同样的技术,让机器人每家每户

挨着去收垃圾,顺道监测空气质量等等。甚至在机器人身上

装上吸尘器,沿街打扫卫生,监测空气中的污染指数等。

P.Dario教授抛出了“橄榄枝”,希望与重庆政府合作,

研发此项技术,用于三峡库区的水污染监测。他相信,浮动

式机器人与传感器结合,比传统监测更适用,监测技术也会

通过国际之间的合作得到更快葡萄牙超级联赛 的发展和完善。 (英)

美科学家发现快速检测抗抑郁药效果的方法

美国科学家发现了一种可以快速确定抗抑郁药物是否

有效的方法,即通过验血检测一种蛋白质在大脑细胞中的位

置变化。

这项研究成果发表在最新一期《神经学杂志》上。从事

这项研究的美国芝加哥伊利诺伊大学的马克・拉斯尼克说,

以往抑郁症病人要等待几周才能确定他们服用的抗抑郁药

是否有效,而用新方法可以在服药后4~5天内通过验血就

能确定抗抑郁药是否有效。拉斯尼克比较了因抑郁症而自

杀的人和没有精神病史的人的大脑,结果发现,一种叫Gs

alpha的蛋白质在脑细胞中的位置是不同的。

抑郁症患者的Gs alpha蛋白质被困在细胞膜中的一个

厚重、呈胶质的区域中,从而影响了Gs alpha的功能。拉斯

尼克在实验中发现,抗抑郁药物帮助Gs alpha转移到可以发

挥其功能的细胞区域。 (高)

油烟排放成为大气污染防治重点

饭店、宾馆、烧烤店随意排放油烟的现象在辽宁省鞍山

市将被禁止。鞍山市环保局不久前宣布,4月中旬起将开展

餐饮业油烟专项整治,从而实现城区大气质量的根本好转。

有研究表明,城区空气中可吸入颗粒物的主要来源,主

要包括餐饮业的油烟和机动车的尾气两方面。近年来鞍山

市在机动车尾气整治上做了大量工作,但随着饮食业迅猛发

展,餐饮业油烟污染已成影响城市空气环境质量的突出问

题,也是市民投诉的热点、难点。

鞍山市在餐饮业油烟专项整治中要求,城区内凡产生油

烟污染的饮食业单位,均须安装与其经营规模相匹配,经环

保部门认证的高效油烟净化设施,并对消音、隔声装置等技

术进行改进,从而使其排放的油烟符合国家《饮食业油烟排

放标准(试行)》的规定。

鞍山城区内今后新建、改建、扩建饮食服务业,应进行环

境影响评价,执行同时设计、施工和投产的环保“三同时”制

度。对于不限期完成油烟净化改造,以及改造后不使用净化

设备的餐饮企业,环保部门将处以2万元以下,并责令

其限期改正。 (莉)

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